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三维荧光光谱则是由激发波长（y轴））一发射波长（x轴）一荧光强度（z轴）三维坐标所表征的矩阵光谱（Excitation—Emission—Matrix Spectra），也叫总发光光谱 （Total luminescence Spectra）。通常的荧光光谱是荧光强度对发射波长扫描所得的平面图。很显然，三维荧光光谱技术不仅能够获得激发波长与发射波长，同时能够获取变化时的荧光强度信息。
物质的荧光强度F与激发光的波长和所测量发射光的波长有关，将F的数据用矩阵形式表示，行和列对应不同的激发光波长和发射光波长，每个矩阵元分别为该激发光、发射光波长的荧光强度F，称之为激发—发射矩阵，简称EEM。描述荧光强度及同时随激发波长和发射波长变化的关系图谱即为三维荧光光谱。三维荧光光谱有两种表示形式。
三维荧光光谱的表示方法三维荧光光谱图的表示方式有两种，即三维投影图和等高线荧光光谱图。
三维投影图
三维荧光光谱收集了试样的总荧光数据，它是一系列的荧光激发光谱和发射光谱的汇集。由计算机收集扫描数据，通常以发射波长作为x轴，激发波长作为y轴，荧光强度作为z轴而构成三维投影图．作图时y轴的激发波长可以由小到大，所得的为正面图，也可以由大到小，所得的为背面图。
人血浆在pH为7.40（磷酸盐缓冲溶液）水溶液中，于23℃温度下记录的总荧光三维投影正面图。此体系的 强荧光峰在紫外光区，而在可见光域的荧光强度则低的很多。
等高线光谱图
在计算机收集总荧光扫描数据之后，用计算机的某种程序或用三维自动绘图仪，以发射波长为x轴，激发波长为夕轴，把荧光强度相等的点用线连接来起，则在平面上形成等高线图，称为等高线荧光光谱图。
三维荧光光谱能测什么1）用血液的等高线荧光光谱检查人体的健康情况。人类的血液由多种成份组成，但只有几种成份对总荧光有影响。当人体的情况出现问题时，总荧光的可见光谱部分就有相当显著的变化。在积累大量主要成份的荧光光谱数据的情况下，从血液的等高线荧光光谱图就可以对病情进行了解和诊断。
2）三维荧光光谱帮助解决刑事案件。三维荧光光谱对于两种汽油样品是否相同，较之气相一液相色谱具有更强的辨别能力，尤其是采用光谱相减法对刑事案件的确证确实大有帮助。例如，在一纵火案的现场获得了一些未尽燃烧的少量汽油样品，而从嫌疑犯处亦获得汽油样品。为确证案犯，可进行三维荧光光谱相减法加以分析判断。测定时，将两个样品分别溶于光谱纯的己烷中配成25ppm的分析试液，进行三维荧光光谱的测量，获得总荧光的数据。然后由计算机对这两个样品的三维荧光光谱进行相减，得出减余光谱。如果这两种样品是同一来源，则所得的减余光谱将是平坦的，任何一点的荧光强度都基本上等于零．如果这两种样品并非来自同一来源，则所得的减余光谱将不是平坦的，而有不少小“山”。
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